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Monitoring, Chimärismusanalysen und Bestimmung der minimalen Resterkrankung (MRD)

Allogene Stammzelltransplantation
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Monitoring, Chimärismusanalysen und Bestimmung der minimalen Resterkrankung (MRD)

Allogene Stammzelltransplantation
Stand: Mai 2016
Autoren: Peter Bader, Martin Bornhäuser, Götz-Ulrich Grigoleit, Nicolaus Kröger für die DAG-KBT, Deutsche Arbeitsgemeinschaft für Knochenmark- und Blutstammzelltransplantation e.V.

1Zusammenfassung

Ziel der allogenen Stammzelltransplantation ist es, das blutbildende System des Patienten durch ein funktionsfähiges Immun- und Hämatopoesesystem eines allogenen Stammzellspenders zu ersetzen. Ob dies gelingt, hängt von mehreren Faktoren ab: hierzu zählen in erster Linie die Intensität des Konditionierungsregimes, die HLA-Identität zwischen Empfänger und Spender, sowie die Tatsache, ob das Transplantat in-vivo oder ex vivo T-Zell depletiert wurde. Ein vollständiges Anwachsen des Transplantates ist Voraussetzung für die Etablierung eines Graft-versus-Leukämie (GvL) Effektes. So ist vor allem in der Frühphase nach allogener Stammzelltransplantation von großer Bedeutung, ob das Transplantat anwächst oder abgestoßen wird. Im weiteren Verlauf tritt die Frage nach dem Wiederauftreten der Grunderkrankung in den Vordergrund [31015]

In den vergangenen Dekaden wurden verschiedene molekularbiologisch basierte Methoden entwickelt, um sowohl den hämatopoetischen Chimärismus zu charakterisieren, als auch submikroskopisch messbare, minimale Resterkrankung (MRD) nachzuweisen [17816].

2Grundlagen

2.1Chimärismusanalyse

2.1.1Definition

Die genotypische Untersuchung der Hämatopoese nach Transplantation dient der Klärung der Frage, ob die regenerierte Blutbildung vom Empfänger oder vom Spender stammt und wird Chimärismusanalyse genannt. Der Begriff „Chimäre“ stammt aus der griechischen Mythologie. Von Homer wurde ein feuerspuckendes Monster mit einem Löwenkopf, einem Ziegenkörper und dem Schwanz einer Schlange beschrieben, die Lytia, eine Region Kleinasiens bedrohte und das schließlich vom altertümlichen Helden Bellerophon besiegt wurde. Die Begriff Chimäre wurde 1956 durch Ford et. al. in die Transplantationsmedizin eingeführt; heute versteht man unter einer Chimäre einen Organismus der die DNA zweier unterschiedlicher Wesen in sich trägt. Dies ist nach einer allogenen Stammzelltransplantation der Fall, wenn das hämatopoetische System eines Patienten von einem anderen Menschen abstammt [315].

In Abhängigkeit des Erfolges der Transplantation können sich verschiedene Formen des hämatopoetischen Chimärismus entwickeln [715]:

  1. vollständiger oder kompletter Chimärismus: die gesamten blutbildenden Zellen stammen vom Spender ab.

  2. Transienter gemischter Chimärismus: in den ersten Wochen nach Transplantation stammt ein Teil der Blutzellen noch vom Empfänger (ca. 1-5%), bevor im weiteren Verlauf ein kompletter Spenderzellchimärismus eintritt.

  3. Stabiler gemischter (stable mixed) Chimärismus: Nach der Transplantation findet sich ein gemischtes Profil mit unterschiedlichem Anteil von Spender- und Empfängerhämatopoese, welches jedoch über die Zeit stabil bleibt.

  4. Progressiver gemischter Chimärismus: Es besteht ein gemischter Anteil von Spender und Empfängerhämatopoese, wobei der Spenderanteil kontinuierlich abnimmt.

  5. Chimärismusverlust (loss of chimerism). Es bestand zumindest ein teilweiser Spenderzellchimärismus der jedoch vollständig verloren gegangen ist (auch sekundäres graft failure).

  6. Splitchimärismus: Es sind nur Zellen einer Zelllinie vom Spender vorhanden, die übrigen Zellreihen stammen aber vom Empfänger ab

2.1.2Methoden

Den heute zur Verfügung stehenden Methoden zur Chimärismusanalyse liegt das Prinzip zugrunde, phänotypische oder genotypische Unterschiede zwischen Spender- und Empfängerhämatopoese darzustellen. Hierzu stehen verschieden Methoden zur Verfügung:

  1. Zytogenetik oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH): X bzw Y-Chromosomen

  2. Restriktionslängenfragment-Polymorphismus (RFLP)

  3. Blutgruppenmerkmale

  4. PCR- Methoden:

    1. Über polymorphe DNS Sequenzen, wie „Short Tandem Repeats“ (STR) oder „ variable number of tandem repeats (VNTR)“ mit anschließender kapillarelektrophoretischer Auftrennung.

    2. Quantitative real-time PCR über „single nucleotide polymorphisms SNP” oder Insertionen oder Deletionen von kurzen DNS Abschnitten (“Indel-polymorphism”)

    3. Digitale PCR

Während Blutgruppenmerkmale und RFLP heute nur noch wenig zum Einsatz kommen, hat die FISH Bestimmung zwar einen Stellenwert bei der getrenntgeschlechtlicher Transplantation, weist jedoch nur eine Sensitivität von ca. 1% auf. Gegenwärtig stellt die PCR basierte Amplifikation der STR Polymorphismen den Goldstandard für die Chimärismusanalyse dar. Die STR-Analyse findet auch in der forensischen Medizin oder in der Vaterschaftsanalytik Anwendung. Für eine sensitive Chimärismusanalyse aber müssen die gewählten Primerpaare optimiert werden, um eine ausreichende Sensitivität zu erreichen. Dies ist in der Regel mit kommerziell erhältlichen Multilokus-Amplifikationskits nicht möglich. Optimierte Testverfahren erlauben den Nachweis einer Minorzellpopulation von regelmäßig 0,1%; dies ist für den quantitativen Nachweis erforderlich [26].

Eine Steigerung der Sensitivität lässt sich bei allen Methoden durch eine vorherige Anreicherung von Zellsubpopulationen (Zelllinien) erreichen. Für die Analysen des linienspezifischen Chimärismus eignen sich die jeweiligen zellspezifischen Marker für T-, B-, NK- Zellen, für Granulozyten, erythropoetische Vorstufen, Plasmazellen oder aber auch die myeloischen Marker CD33 und CD34. Erfolgt eine Anreicherung bestimmter Zellsubpopulationen vor der Chimärismusanalyse so erhöht sich die Sensitivität zum Nachweis einer Minorpopulation von 1x10-2 bis auf 1x10-4 [1112].

Eine ähnliche Sensitivität (10-4) kann auch mit Realtime-PCR basierten Verfahren erreicht werden. Die hohe Sensitivität der qPCR ist methodenbedingt auch mit einer begrenzten Genauigkeit im Bereich des gemischten Chimärismus (zwischen 90 und 10%) verbunden. Die Limitation konnte durch die Einführung der digitalen PCR in die Chimärismusdiagnostik überwunden werden [1314].

2.1.3Einsatz in der klinischen Nachsorge

2.1.3.1Dokumentation des Engraftments

Mit Hilfe PCR basierter Detektionsverfahren ist es möglich, sehr geringe Zellzahlen zu analysieren. Dies ermöglicht es deshalb, das Anwachsen des Transplantates zu verfolgen und zu dokumentieren. Dies ist vor allem bei Patienten mit einem hohen Abstoßungsrisiko indiziert. Dazu gehören Patienten mit einer schweren aplastischen Anämie, Patienten die ein T-Zell depletiertes Transplantat erhalten und alle Patienten, die von einem nichtpassenden Spender transplantiert werden. Es konnte durch zahlreiche Untersuchungen belegt werden, dass durch wöchentliche Untersuchungen, diese können bereits ab der zweiten Woche beginnen, drohende Abstoßungen erkannt werden können. Bei diesen Hochrisikopatienten ist die Chimärismusanalyse in Zellsubpopulationen anzuraten. Dies gilt im Besonderen für die CD3+ T-Zellen sowie für CD3-/CD56+ NK-Zellen. Es wird empfohlen, im Rahmen hapoloidentischer, T-Zell depletierter Transplantationen den hämatopoetischen Chimärismus auch in der CD-3 Fraktion während des Zeitraumes des Engraftments bis zum Tag +28 zweimal wöchentlich zu untersuchen umso frühe Abstoßungen zu erkennen.

Insgesamt gilt, dass spätestens zum Tag +28 durch eine Chimärismusanalyse die erfolgreiche Transplantation dokumentiert werden sollte, um bei einem fehlenden „Engraftment“ zeitnah weitere therapeutische Schritte einleiten zu können.

2.1.3.2Rezidivfrüherkennung nach allogener Stammzelltransplantation

Für die Rezidivfrüherkennung nach allogener Stammzelltransplantation sind prinzipiell zwei verschiedene Methoden einsetzbar: 1) Charakterisierung des hämatopoetischen Chimärismus und 2) Analyse der minimalen Resterkrankung. Mittels MRD Untersuchungen wird der maligne Zellklon direkt nachgewiesen; die Chimärismusanalyse weißt hingegen in der Regel nichtmaligne Zellen der Hämatopoese nach. Es stehen für beide Verfahren verschiedene PCR-basierte Methoden sowie die Immunphänotypisierung zur Verfügung [315].

2.1.3.3Bedeutung des hämatopoetischen Chimärismus für das Wiederauftreten der Grunderkrankung:

Der molekulare Nachweis persistierender oder wiederauftretender autologer Zellen kann sowohl überlebende Hämatopoese, Leukämieblasten und in seltenen Fällen auch beides darstellen. Chimärismusanalysen sind nur bedingt als MRD Untersuchungen geeignet. Es konnte durch prospektive Untersuchungen bereits in den frühen 1990-iger Jahren nachgewiesen werden, dass ein gemischter Chimärismus häufig in hämatopoetischen Zellen entsteht, so zu einer Abschwächung des GVL Effektes führt, und das Wiederauftreten der Grunderkrankung erleichtert. Es ist klar geworden, dass die Entwicklung des hämatopoetischen Chimärismus ein dynamischer Prozess ist. Aus diesem Grunde sollten Untersuchungen in kurzen Zeitintervallen vorgenommen werden, wenn mit diesen Aufschluss über das Rezidivrisiko gewonnen werden soll [315].

Durch serielle Chimärismusuntersuchungen konnten viele, zunächst vor allem pädiatrische, dann auch internistische Studien zweifelsfrei zeigen, dass Patienten mit einem gemischten Chimärismus ein deutlich gesteigertes Rezidivrisiko tragen. Auch konnte von diesen und weiteren Studien klar gezeigt werden, dass durch eine immuntherapeutische Intervention ein gemischter Chimärismus bei vielen Patienten zu einem vollständigen Spenderchimärismus konvertiert und so ein offenes Rezidiv verhindert werden konnte [131012].

Sollten Chimärismusuntersuchungen im peripheren Blut zur Rezidiv Vorhersage durchgeführt werden, so sollten diese in den ersten 6 Monaten krankheitsadaptiert wöchentlich bis zweiwöchentlich, mindestens jedoch einmal pro Monat durchgeführt werden [23612].

Wie erwähnt, geben Chimärismusanalysen Aufschluss über Alloreaktiviät und/oder Toleranzinduktion des Transplantates. Aufgrund der relativ geringen Sensitivität von etwa 1% zum Nachweis einer Minorfraktion, eigenen sich Chimärismusuntersuchungen im gesamten peripheren Blut nicht als MRD-Marker. Zu diesem Zweck sollten, wenn möglich, andere Verfahren eingesetzt werden.

Die Interpretation des Chimärismus sollte jedoch immer im Kontext der Grundkrankheit und des Therapiezieles stehen. Bei nicht malignen Erkrankungen wie z.B. Aplastische Anämie ist ein stabiler gemischter Chimärismus für den Transplantationserfolg ausreichend, während bei Patienten mit malignen hämatologischen Erkrankungen ein nicht kompletter Spenderzell-Chimärismus, wie oben beschrieben, mit der Entwicklung eines klinischen Rezidivs assoziiert ist [3101115].

2.2MRD Bestimmung

Im Gegensatz zu den Chimärismusanalysen lassen sich bei der Untersuchung der minimalen Resterkrankung maligne Zellen direkt nachweisen. Dazu sollen MRD-Untersuchungen mit Methoden durchgeführt werden, die es erlauben, krankheitsspezifische Veränderungen der Zellen zu erfassen. Hierzu gehören [4891117]:

  1. PCR basierte Methoden wie z.B. die Analyse der TCR- oder Immunglobulinschwerketten- (IG-) Rearrangements für Patienten mit ALL, Nachweis des BCR/ABL Fusionsproteins für Patienten mit CML und ALL, NPM1, FLT-3, RUNX1, MLL für einen Teil der Patienten mit AML, JAKV617F, MPL oder Calreticulin für MPN u.va.

  2. Immunphänotypisierung mittels der Multiparameter-Immunphänotypisierung zum Nachweis verschiedenster leukämieassoziierter Phänotypen.

  3. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH): zum Nachweis bestehender chromo-somaler Abberationen : z.B 5q, -7, +8 u.v. (NGS),

  4. Sequenzierung über Sanger oder Next Generation Sequencing.

Mehrere prospektive Untersuchungen im Erwachsenen- und im Kindesalter haben zweifelsfrei die Wichtigkeit dieser Untersuchungen nachgewiesen. Es ist unzweifelhaft, dass die Höhe der MRD zum Zeitpunkt der Transplantation vor allem bei ALL einen wesentlichen Einfluss auf das Überleben der Patienten hat. In den vergangen Jahren konnten zudem mehrere Studie belegen, dass durch systematische Untersuchungen der MRD im Knochenmark nach allogener Stammzelltransplantation, das Rezidiv vorausgesagt werden kann. So können MRD Untersuchungen nach Transplantation nunmehr klare Indikatoren für eine präemptive Therapie zur Verhinderung eines zytologisch manifesten Rezidivs sein. Durch die neuen Sequenziermethoden ist es heute bei der überwiegenden Anzahl der Patienten mit hämatologischen Erkrankungen möglich, einen spezifischen Krankheitsmarker zu detektieren [4581017].

Welche Untersuchungen durchgeführt werden sollen, hängt von der zugrunde liegenden Erkrankung ab. Ähnlich wie bei der Chimärismusbestimmung ist die Sensitivität der verschiedenen Untersuchungsmethoden unterschiedlich, aber für die Beurteilung des Befundes relevant.

Welche Methode auch immer eingesetzt wird, unabdingbare Voraussetzung für das Monitoring nach Transplantation sowohl mit Chimärismus- als auch MRD- Methoden ist deren Standardisierung und Qualitätssicherung. Bei entsprechender Durchführung erlauben Chimärismus und MRD Untersuchungen nicht nur die Dokumentation des Engraftments und die Erfassung einer Transplantatabstoßung sondern auch die Rezidivfrüherkennung und ermöglichen so die Steuerung einer präemptiven bzw. früh interventionellen Rezidivtherapie.

3[Kapitel nicht relevant]

4[Kapitel nicht relevant]

5[Kapitel nicht relevant]

6[Kapitel nicht relevant]

7[Kapitel nicht relevant]

8[Kapitel nicht relevant]

9[Kapitel nicht relevant]

10Literatur

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  15. Thiede C, Meyer RG, Bader B: Chimärismusanalysen. In: Herr W, Theobald M, Ehninger G, Einsele H, Meyer RG (eds). Hämatopoetische Stammzellen - Grundlagen und klinische Einsatzgebiete. Deutscher Ärzte Verlag: Köln, 2015, pp 157-161, 2015.

  16. van Dongen JJ, van der Velden VH, Bruggemann M, Orfao A: Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood 125:3996-4009, 2015. DOI:10.1182/blood-2015-03-580027

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11[Kapitel nicht relevant]

12[Kapitel nicht relevant]

13[Kapitel nicht relevant]

14[Kapitel nicht relevant]

15Anschriften der Experten

Prof. Dr. Peter Bader
Schwerpunkt Stammzelltransplantation und Immunologie
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Theodor-Stern-Kai 7 (Haus 32 D)
60590 Frankfurt am Main
Tel: 069 6301-7542
Prof. Dr. med. Martin Bornhäuser
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
Technische Universität Dresden
Medizinische Klinik und Poliklinik I
Fetscher Str. 74
01307 Dresden
Tel: 0351 458-4704
Fax: 0351 449210612
Dr. med. Götz-Ulrich Grigoleit
Universitätsklinikum Würzburg
Medizinische Klinik II
Zentrum für allogene
Blutstammzelltransplantation
Oberdürrbacher Str. 6
97080 Würzburg
Prof. Dr. med. Nicolaus Kröger
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Klinik für Stammzelltransplantation
Onkologische Station
Martinistr. 52
20246 Hamburg
Tel: 040 7410-54581
Fax: 040 7410-53795

16Erklärung zu möglichen Interessenkonflikten

nach den Regeln der DGHO Deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Medizinische Onkologie und den Empfehlungen der AWMF (Version vom 23. April 2010) und internationalen Empfehlungen.